مايكروسكوب بصري

رسم تخطيطي لمجهر بسيط

هناك نوعان أساسيان من المجاهر الضوئية: المجاهر البسيطة والمجاهر المركبة. يستخدم المجهر البسيط القوة البصرية لعدسة واحدة أو مجموعة من العدسات من أجل التكبير. يستخدم المجهر المركب نظامًا من العدسات (مجموعة واحدة تكبر الصورة التي تنتجها مجموعة أخرى) لتحقيق تكبير أعلى بكثير لجسم ما. الغالبية العظمى من مجاهر البحث الحديثة هي مجاهر مركبة بينما بعض المجاهر الرقمية التجارية الأرخص هي مجاهر عدسة واحدة بسيطة. يمكن تقسيم المجاهر المركبة أيضًا إلى مجموعة متنوعة من أنواع المجاهر الأخرى التي تختلف في تكويناتها البصرية وتكلفتها وأغراضها المقصودة.

مجهر بسيط

يستخدم المجهر البسيط عدسة أو مجموعة من العدسات لتكبير كائن من خلال التكبير الزاوي وحده ، مما يمنح المشاهد صورة افتراضية مكبرة منتصبة . ^{[1] [2]} تم العثور على استخدام عدسة محدبة واحدة أو مجموعة من العدسات في أجهزة تكبير بسيطة مثل العدسة المكبرة ، العدسات المكبرة ، والعدسات العينية للتلسكوبات والمجاهر.

المجهر المركب

رسم تخطيطي لمجهر مركب

يستخدم المجهر المركب عدسة قريبة من الكائن الذي يتم عرضه لجمع الضوء (تسمى العدسة الموضوعية ) التي تركز على صورة حقيقية للكائن داخل المجهر (الصورة 1). يتم بعد ذلك تكبير هذه الصورة بواسطة عدسة ثانية أو مجموعة من العدسات (تسمى العدسة العينية ) والتي تمنح المشاهد صورة افتراضية مكبرة مقلوبة للكائن (الصورة 2). ^[3] يسمح استخدام تركيبة الهدف / العدسة المركبة بتكبير أعلى بكثير. غالبًا ما تحتوي المجاهر المركبة الشائعة على عدسات موضوعية قابلة للتبديل ، مما يسمح للمستخدم بضبط التكبير بسرعة. ^[3] يتيح المجهر المركب أيضًا إعدادات إضاءة أكثر تقدمًا ، مثل تباين الطور .

المتغيرات المجهرية الأخرى

هناك العديد من المتغيرات لتصميم المجهر الضوئي المركب لأغراض متخصصة. بعض هذه الاختلافات في التصميم المادي تسمح بالتخصص لأغراض معينة:

• مجهر ستيريو ، مجهر منخفض الطاقة يوفر رؤية مجسمة للعينة ، يشيع استخدامه للتشريح.
• مجهر المقارنة ، الذي يحتوي على مسارين منفصلين للضوء يسمحان بإجراء مقارنة مباشرة بين عينتين عبر صورة واحدة في كل عين.
• مجهر مقلوب لدراسة العينات من الأسفل. مفيد لمزارع الخلايا في السائل ، أو لعلم المعادن.
• مجهر فحص موصل الألياف الضوئية ، مصمم لفحص نهاية الموصل
• مجهر متحرك لدراسة العينات ذات الدقة الضوئية العالية .

تم تصميم متغيرات المجهر الأخرى لتقنيات الإضاءة المختلفة:

• المجهر البتروغرافي ، الذي يشتمل تصميمه عادةً على مرشح استقطاب ومرحلة دوارة وصفيحة جبسية لتسهيل دراسة المعادن أو المواد البلورية الأخرى التي يمكن أن تختلف خصائصها الضوئية باختلاف الاتجاه.
• مجهر مستقطب شبيه بالمجهر الصخري.
• مجهر تباين الطور ، الذي يطبق طريقة إضاءة تباين الطور.
• مجهر Epifluorescence ، مصمم لتحليل العينات التي تشمل الفلور.
• مجهر متحد البؤر ، وهو نوع مستخدَم على نطاق واسع من الإضاءة المتوهجة التي تستخدم ليزر مسح لإضاءة عينة من أجل التألق.
• مجهر ثنائي الفوتون ، يستخدم لتصوير الفلورة بشكل أعمق في وسائط التشتت وتقليل التبييض الضوئي ، خاصة في العينات الحية.
• مجهر الطالب - غالبًا ما يكون مجهرًا منخفض الطاقة مزودًا بعناصر تحكم مبسطة وأحيانًا بصريات منخفضة الجودة مصممة للاستخدام المدرسي أو كأداة بداية للأطفال. ^[4]
• Ultramicroscope ، وهو مجهر ضوئي مكيف يستخدم تشتت الضوء للسماح برؤية الجسيمات الدقيقة التي يكون قطرها أقل أو بالقرب من الطول الموجي للضوء المرئي (حوالي 500 نانومتر) ؛ في الغالب عفا عليها الزمن منذ ظهور المجاهر الإلكترونية
• مجهر رامان المحسّن بطرف ، هو نوع من المجهر البصري يعتمد على مطيافية رامان المحسّنة بالطرف ، دون حدود الدقة التقليدية المستندة إلى الطول الموجي. ^{[5] [6] تحقق} هذا المجهر بشكل أساسي على منصات مجهر مسبار المسح باستخدام جميع الأدوات البصرية.

مجهر رقمي

مجهر USB مصغر .

A المجهر الرقمي هو المجهر مزودة كاميرا رقمية تسمح للمراقبة من عينة عن طريق الكمبيوتر . يمكن أيضًا التحكم في المجاهر جزئيًا أو كليًا بواسطة الكمبيوتر بمستويات مختلفة من الأتمتة. يسمح الفحص المجهري الرقمي بتحليل أكبر للصورة المجهرية ، على سبيل المثال ، قياسات المسافات والمساحات وتقدير الصبغة الفلورية أو النسيجية .

المجاهر الرقمية منخفضة الطاقة ، مجاهر USB ، متوفرة أيضًا تجارياً. هذه هي في الأساس كاميرات ويب مع عدسة ماكرو عالية الطاقة ولا تستخدم بشكل عام الإضاءة . الكاميرا متصلة مباشرة بمنفذ USB للكمبيوتر بحيث تظهر الصور مباشرة على الشاشة. أنها توفر تكبير متواضع (حتى حوالي 200 ×) دون الحاجة إلى استخدام العدسات ، وبتكلفة منخفضة للغاية. عادةً ما يتم توفير إضاءة عالية الطاقة بواسطة مصدر LED أو مصادر مجاورة لعدسة الكاميرا.

يتوفر الفحص المجهري الرقمي بمستويات إضاءة منخفضة للغاية لتجنب تلف العينات البيولوجية الضعيفة باستخدام الكاميرات الرقمية الحساسة لعد الفوتون . لقد ثبت أن مصدر الضوء الذي يوفر أزواجًا من الفوتونات المتشابكة قد يقلل من مخاطر تلف العينات الأكثر حساسية للضوء. في هذا التطبيق لتصوير الأشباح للفوتون المجهري المتناثر ، تضيء العينة بفوتونات الأشعة تحت الحمراء ، كل منها مرتبط مكانيًا بشريك متشابك في النطاق المرئي للتصوير الفعال بواسطة كاميرا عد الفوتون. ^[7]

اختراع

كانت أقدم المجاهر عبارة عن عدسات مكبرة أحادية العدسة ذات تكبير محدود يعود تاريخها على الأقل إلى الاستخدام الواسع النطاق للعدسات في النظارات في القرن الثالث عشر. ^[8]

ظهرت المجاهر المركبة لأول مرة في أوروبا حوالي عام 1620 ^{[9] [10]} بما في ذلك مجهر أظهره كورنيليس دريبل في لندن (حوالي 1621) وآخر معروض في روما عام 1624. ^{[11] [12]}

المخترع الفعلي للمجهر المركب غير معروف على الرغم من تقديم العديد من الادعاءات على مر السنين. يتضمن ذلك ادعاءً بعد 35 ^[13] عامًا من ظهورها من قبل صانع النظارات الهولندي يوهانس زاكرياسن أن والده ، زكريا يانسن ، اخترع المجهر المركب و / أو التلسكوب في وقت مبكر من عام 1590. يوهانس (يدعي البعض أنه مشكوك فيه) ^{[14] [15] [16]} الشهادة تدفع بتاريخ الاختراع إلى الوراء حتى أن زكريا كان طفلًا في ذلك الوقت ، مما أدى إلى تكهنات بأنه ، من أجل صحة ادعاء يوهانس ، كان لابد أن يكون المجهر المركب قد اخترعه يوهانس. الجد ، هانز مارتينز. ^[17] وهناك ادعاء آخر هو أن منافس يانسن ، هانز ليبرشي (الذي تقدم بطلب للحصول على براءة اختراع التلسكوب الأولى في عام 1608) اخترع أيضًا المجهر المركب. ^[18] يشير مؤرخون آخرون إلى المبتكر الهولندي كورنيليس دريبل بمجهره المركب عام 1621. ^{[11] [12]}

يُشار أحيانًا إلى جاليليو جاليلي كمخترع ميكروسكوب مركب. بعد عام 1610 ، وجد أنه يمكنه التركيز على تلسكوبه عن قرب لرؤية الأشياء الصغيرة ، مثل الذباب ، عن قرب ^[19] و / أو يمكنه النظر من خلال النهاية الخطأ في الاتجاه المعاكس لتكبير الأجسام الصغيرة. ^[20] وكان العيب الوحيد هو أن تلسكوبه الذي يبلغ طوله 2 قدم يجب أن يمتد إلى 6 أقدام لرؤية الأشياء القريبة. ^[21] بعد رؤية المجهر المركب الذي بناه دريبل والمعرض في روما عام 1624 ، بنى جاليليو نسخته المحسنة. ^{[11] [12]} في عام 1625 ، صاغ جيوفاني فابر اسم مجهر للميكروسكوب المركب جاليليو المقدم إلى أكاديمية دي لينسي في عام 1624 ^[22] (أطلق عليه جاليليو اسم " أوكيولينو " أو " العين الصغيرة "). صاغ فابر الاسم من الكلمات اليونانية μικρόν (ميكرون) التي تعني "صغير" ، و σκοπεῖν (skopein) تعني "أن ننظر إلى" ، وهو اسم يقصد أن يكون مشابهًا لكلمة " تلسكوب " ، وهي كلمة أخرى صاغها اللانكيون. ^[23]

كريستيان هيغنز ، وهو هولندي آخر ، طور نظامًا بسيطًا للعين ثنائي العدسة في أواخر القرن السابع عشر تم تصحيحه لونيًا ، وبالتالي كان خطوة كبيرة إلى الأمام في تطوير المجهر. لا يزال يتم إنتاج Huygens ocular حتى يومنا هذا ، ولكنه يعاني من حجم حقل صغير ، وعيوب طفيفة أخرى.

تعميم

أقدم صورة منشورة معروفة بأنها صُنعت بالمجهر: النحل بقلم فرانشيسكو ستيلوتي ، 1630 ^[24]

يعود الفضل إلى أنتوني فان ليفينهوك (1632-1724) في لفت انتباه علماء الأحياء إلى المجهر ، على الرغم من أن العدسات المكبرة البسيطة كانت تُنتج بالفعل في القرن السادس عشر. كانت مجاهر Van Leeuwenhoek محلية الصنع عبارة عن مجاهر بسيطة ، مع عدسة واحدة صغيرة جدًا ولكنها قوية. كانت محرجة في الاستخدام ، لكنها مكنت فان ليفينهوك من رؤية صور مفصلة. استغرق الأمر حوالي 150 عامًا من التطوير البصري قبل أن يتمكن المجهر المركب من تقديم نفس جودة الصورة مثل مجاهر van Leeuwenhoek البسيطة ، بسبب الصعوبات في تكوين عدسات متعددة. في خمسينيات القرن التاسع عشر ، اخترع جون ليونارد ريدل ، أستاذ الكيمياء في جامعة تولين ، أول مجهر عملي ثنائي العينين أثناء إجراء واحدة من أولى الاستقصاءات المجهرية الأمريكية وأكثرها شمولاً حول الكوليرا . ^{[25] [26]}

تقنيات الإضاءة

في حين أن تقنية المجهر الأساسية والبصريات متاحة منذ أكثر من 400 عام ، فقد تم تطوير تقنيات إضاءة العينة مؤخرًا لتوليد الصور عالية الجودة التي نراها اليوم.

في أغسطس 1893 ، طور August Köhler إضاءة Köhler . تؤدي طريقة إضاءة العينة هذه إلى إضاءة متساوية للغاية وتتغلب على العديد من القيود المفروضة على التقنيات القديمة لإضاءة العينة. قبل تطوير إضاءة كولر ، كانت صورة مصدر الضوء ، على سبيل المثال خيوط المصباح ، مرئية دائمًا في صورة العينة.

و جائزة نوبل منحت في الفيزياء لالفيزيائي الهولندي فريتس زيرنيكه في عام 1953 لتطويره من النقيض من المرحلة الإضاءة والتي تتيح التصوير العينات الشفافة. باستخدام التداخل بدلاً من امتصاص الضوء ، يمكن تصوير عينات شديدة الشفافية ، مثل خلايا الثدييات الحية ، دون الحاجة إلى استخدام تقنيات التلوين. بعد عامين فقط ، في عام 1955 ، نشر جورج نومارسكي نظرية الفحص المجهري للتداخل التفاضلي ، وهي تقنية تصوير أخرى قائمة على التداخل .

المجهر مضان

يعتمد الفحص المجهري البيولوجي الحديث بشكل كبير على تطوير مجسات الفلورسنت لهياكل محددة داخل الخلية. على عكس الفحص المجهري للضوء العادي ، في الفحص المجهري الفلوري ، تضيء العينة من خلال العدسة الموضوعية بمجموعة ضيقة من الأطوال الموجية للضوء. يتفاعل هذا الضوء مع الفلوروفور في العينة الذي ينبعث منه بعد ذلك ضوء ذو طول موجي أطول . هذا الضوء المنبعث هو الذي يشكل الصورة.

منذ منتصف القرن العشرين ، تم استخدام بقع الفلورسنت الكيميائية ، مثل DAPI التي ترتبط بالحمض النووي ، لتسمية هياكل معينة داخل الخلية. تشمل التطورات الحديثة التألق المناعي ، الذي يستخدم الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية للتعرف على بروتينات معينة داخل العينة ، والبروتينات الفلورية مثل GFP التي يمكن أن تعبر عنها الخلية الحية مما يجعلها مشعة.

عناصر مجهر الإرسال الضوئي الأساسية (التسعينيات)

تشترك جميع المجاهر الضوئية الحديثة المصممة لعرض العينات عن طريق الضوء المرسل في نفس المكونات الأساسية لمسار الضوء. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الغالبية العظمى من المجاهر لها نفس المكونات "الهيكلية" ^[27] (مرقمة أدناه وفقًا للصورة الموجودة على اليمين):

• المنظار (عدسة العين) (1)
• برج موضوعي أو مسدس أو قطعة أنف دوارة (لتثبيت عدسات موضوعية متعددة) (2)
• عدسات موضوعية (3)
• مقابض التركيز (لتحريك المرحلة)
  • تعديل خشن (4)
  • ضبط دقيق (5)
• المرحلة (لعقد العينة) [6)
• مصدر الضوء ( ضوء او مرآة ) (7)
• الحجاب الحاجز والمكثف (8)
• المرحلة الميكانيكية (9)

العدسة العينية (عدسة عينية)

و العدسة ، أو عدسة العين، واسطوانة تحتوي على اثنين أو أكثر من العدسات. وتتمثل مهمتها في جعل الصورة موضع تركيز للعين. يتم إدخال العدسة في الطرف العلوي لأنبوب الجسم. العدسات قابلة للتبديل ويمكن إدخال العديد من العدسات المختلفة بدرجات تكبير مختلفة. تتضمن قيم التكبير النموذجية للعدسات 5 × و 10 × (الأكثر شيوعًا) و 15 × و 20 ×. في بعض المجاهر عالية الأداء ، تتم مطابقة التكوين البصري للعدسة الشيئية والعينية لتقديم أفضل أداء بصري ممكن. يحدث هذا بشكل شائع مع الأهداف غير اللونية .

برج موضوعي (مسدس أو قطعة أنف دوارة)

البرج الموضوعي أو المسدس أو قطعة الأنف الدوارة هي الجزء الذي يحمل مجموعة العدسات الموضوعية. يسمح للمستخدم بالتبديل بين العدسات الموضوعية.

عدسة موضعيه او شيئيه

في الطرف السفلي من المجهر الضوئي المركب النموذجي ، توجد عدسة موضوعية واحدة أو أكثر تجمع الضوء من العينة. يكون الهدف عادةً في حاوية أسطوانية تحتوي على عدسة مركبة زجاجية مفردة أو متعددة العناصر. عادة سيكون هناك حوالي ثلاث عدسات موضوعية مثبتة في قطعة أنف دائرية يمكن تدويرها لتحديد العدسة الشيئية المطلوبة. تم تصميم هذه الترتيبات لتكون محورية البؤرة ، مما يعني أنه عندما تتغير إحدى العدسات من عدسة إلى أخرى على المجهر ، تظل العينة في التركيز . تتميز الأهداف المجهر من قبل معلمتين، وهي التكبير و الفتحة العددية . يتراوح الأول نموذجيًا من 5 × إلى 100 × بينما يتراوح الأخير من 0.14 إلى 0.7 ، المقابلة لأطوال بؤرية من حوالي 40 إلى 2 مم ، على التوالي. عادةً ما تحتوي العدسات الموضوعية ذات التكبير العالي على فتحة عددية أعلى وعمق مجال أقصر في الصورة الناتجة. قد تتطلب بعض العدسات الموضوعية عالية الأداء عدسات متطابقة لتقديم أفضل أداء بصري.

هدف الغمر بالزيت

اثنان من عدسات مجهر غمر زيت لايكا : 100 × (يسار) و 40 × (يمين)

تستفيد بعض المجاهر من أهداف الغمر بالزيت أو أهداف الغمر في الماء للحصول على دقة أكبر عند التكبير العالي. يتم استخدامها مع مواد مطابقة الفهرس مثل زيت الغمر أو الماء وغطاء غطاء متطابق بين العدسة الشيئية والعينة. يكون معامل الانكسار للمادة المطابقة للمؤشر أعلى من الهواء مما يسمح للعدسة الشيئية بأن يكون لها فتحة عددية أكبر (أكبر من 1) بحيث ينتقل الضوء من العينة إلى الوجه الخارجي للعدسة الشيئية بأقل قدر من الانكسار. يمكن تحقيق فتحات عددية تصل إلى 1.6. ^[28] تسمح الفتحة العددية الأكبر بجمع المزيد من الضوء مما يجعل الملاحظة التفصيلية للتفاصيل الأصغر ممكنة. عادةً ما يكون لعدسة الغمر بالزيت تكبير من 40 إلى 100 ×.

مقابض التركيز

تعمل مقابض الضبط على تحريك المرحلة لأعلى ولأسفل مع ضبط منفصل للتركيز البؤري الخشن والدقيق. تمكّن نفس عناصر التحكم المجهر من التكيف مع العينات ذات السماكة المختلفة. في التصميمات القديمة للمجاهر ، تقوم عجلات ضبط التركيز بتحريك أنبوب المجهر لأعلى أو لأسفل بالنسبة للحامل ولها مرحلة ثابتة.

إطار

عادةً ما يتم توصيل المجموعة البصرية بأكملها بذراع صلب ، والذي يتم ربطه بدوره بقدم قوية على شكل حرف U لتوفير الصلابة اللازمة. قد تكون زاوية الذراع قابلة للتعديل للسماح بضبط زاوية الرؤية.

يوفر الإطار نقطة تثبيت للعديد من أدوات التحكم في المجهر. عادةً ما يتضمن ذلك عناصر تحكم للتركيز ، وعادةً ما تكون عجلة كبيرة مخرشة لضبط التركيز الخشن ، جنبًا إلى جنب مع عجلة مخرشة أصغر للتحكم في التركيز الدقيق. قد تكون الميزات الأخرى عبارة عن عناصر تحكم في المصباح و / أو عناصر تحكم لضبط المكثف.

المسرح

المرحلة عبارة عن منصة أسفل العدسة الموضوعية تدعم العينة التي يتم عرضها. يوجد في وسط المسرح ثقب يمر من خلاله الضوء لإلقاء الضوء على العينة. تحتوي المرحلة عادةً على أذرع لتثبيت الشرائح (ألواح زجاجية مستطيلة ذات أبعاد نموذجية 25 × 75 مم ، يتم تركيب العينة عليها).

عند التكبيرات التي تزيد عن 100 × ، لا يكون تحريك الشريحة باليد أمرًا عمليًا. تسمح المرحلة الميكانيكية ، النموذجية للمجاهر المتوسطة والعالية السعر ، بحركات صغيرة للشريحة عبر مقابض التحكم التي تعيد وضع العينة / الشريحة حسب الرغبة. إذا لم يكن لدى المجهر في الأصل مرحلة ميكانيكية ، فقد يكون من الممكن إضافة واحدة.

تتحرك جميع المراحل لأعلى ولأسفل للتركيز. مع شرائح المرحلة الميكانيكية ، تتحرك على محورين أفقيين لتحديد موضع العينة لفحص تفاصيل العينة.

يبدأ التركيز بتكبير أقل من أجل تركيز العينة من قبل المستخدم على المسرح. يتطلب الانتقال إلى تكبير أعلى تحريك المرحلة رأسياً أعلى لإعادة التركيز عند التكبير الأعلى وقد يتطلب أيضًا تعديل موضع العينة الأفقي الطفيف. تعد تعديلات موضع العينة الأفقية سببًا لوجود مرحلة ميكانيكية.

نظرًا لصعوبة تحضير العينات وتثبيتها على الشرائح ، فمن الأفضل للأطفال البدء بشرائح مُعدّة تتمركز في المنتصف وتركز بسهولة بغض النظر عن مستوى التركيز المستخدم.

مصدر ضوء

يمكن استخدام العديد من مصادر الضوء. في أبسط صوره ، يتم توجيه ضوء النهار عبر مرآة . معظم المجاهر، ومع ذلك، فقد الخاصة للتعديل والسيطرة عليها مصدرها ضوء - في كثير من الأحيان مصابيح الهالوجين ، على الرغم من أن الإضاءة باستخدام المصابيح و الليزر أصبحت توفير أكثر شيوعا. غالبًا ما يتم توفير إضاءة كولر على أدوات باهظة الثمن.

مكثف

و المكثف هو عدسة صممت لتركيز الضوء من مصدر إضاءة على العينة. قد يشتمل المكثف أيضًا على ميزات أخرى ، مثل الحجاب الحاجز و / أو المرشحات ، لإدارة جودة الإضاءة وشدتها. للإضاءة تقنيات مثل حقل مظلم ، الطوري و تدخل الفرق النقيض المجهري المكونات البصرية إضافية يجب أن تكون محاذاة على وجه التحديد في مسار الضوء.

القوة الفعلية أو التكبير الفعلي لمجهر بصري مركب هو نتاج قوى العين ( العدسة ) والعدسة الشيئية. الحد الأقصى للتكبير العادي للعين والهدف هو 10 × و 100 × على التوالي ، مما يعطي تكبيرًا نهائيًا قدره 1000 ×.

التكبير والصور المجهرية

عند استخدام الكاميرا لالتقاط صورة مجهرية ، يجب أن يأخذ التكبير الفعال للصورة في الاعتبار حجم الصورة. هذا مستقل عما إذا كان على طباعة من فيلم سلبي أو معروض رقميًا على شاشة الكمبيوتر .

في حالة كاميرات التصوير الفوتوغرافي ، يكون الحساب بسيطًا ؛ التكبير النهائي هو نتاج: تكبير العدسة الشيئية ، تكبير بصريات الكاميرا وعامل تكبير طباعة الفيلم بالنسبة إلى السلبية. تبلغ القيمة النموذجية لعامل التكبير حوالي 5 × (لحالة فيلم 35 مم وطباعة 15 × 10 سم (6 × 4 بوصات)).

في حالة الكاميرات الرقمية ، يجب معرفة حجم البكسل في كاشف CMOS أو CCD وحجم البكسل على الشاشة. يمكن بعد ذلك حساب عامل التوسيع من الكاشف إلى البكسل على الشاشة. كما هو الحال مع كاميرا الفيلم ، فإن التكبير النهائي هو نتاج: تكبير العدسة الشيئية ، تكبير بصريات الكاميرا وعامل التكبير.

الولايات المتحدة CBP مكتب العمليات الميدانية وكيل التحقق من صحة وجود وثيقة سفر في أي مطار دولي باستخدام مجهر ستيريو

تقنيات الإضاءة

تتوفر العديد من التقنيات التي تعدل مسار الضوء لإنشاء صورة تباين محسنة من عينة. وتشمل التقنيات الرئيسية لتوليد زيادة على النقيض من العينة ضوء عبر الاستقطاب ، الحقل الظلام ، الطوري و التفاضلية تدخل النقيض الإضاءة. تجمع تقنية حديثة ( Sarfus ) بين الضوء المستقطب المتقاطع والشرائح المعززة بالتباين المحددة لتصور العينات النانومترية.

• أربعة أمثلة لتقنيات النقل المستخدمة لتوليد التباين في عينة من المناديل الورقية . 1.559 ميكرومتر / بكسل.
• 

  إضاءة المجال الساطع ، تباين العينة يأتي من امتصاص الضوء في العينة.

• 

  إضاءة ضوئية مستقطبة متقاطعة ، تباين العينة يأتي من دوران الضوء المستقطب عبر العينة.

• 

  إضاءة المجال المظلم ، تباين العينة يأتي من الضوء المنتشر في العينة.

• 

  إضاءة تباين الطور ، تباين العينة يأتي من تداخل أطوال مسار الضوء المختلفة عبر العينة.

تقنيات أخرى

تسمح المجاهر الحديثة بأكثر من مجرد مراقبة الصورة الضوئية المرسلة للعينة ؛ هناك العديد من التقنيات التي يمكن استخدامها لاستخراج أنواع أخرى من البيانات. تتطلب معظم هذه الأجهزة معدات إضافية بالإضافة إلى مجهر مركب أساسي.

• الضوء المنعكس ، أو الإضاءة الحادثة (لتحليل الهياكل السطحية)
• الفحص المجهري الفلوري ، كلاهما:

• الفحص المجهري Epifluorescence
• المجهر متحد البؤر

• التحليل الطيفي المجهري (حيث يتم دمج مقياس الطيف الضوئي المرئي فوق البنفسجي مع مجهر ضوئي)
• الفحص المجهري فوق البنفسجي
• الفحص المجهري القريب من الأشعة تحت الحمراء
• الفحص المجهري متعدد الإرسال ^[29] لتحسين التباين وتقليل الانحراف.
• الأتمتة (للمسح التلقائي لعينة كبيرة أو التقاط صورة)

صورة مكبرة 40x للخلايا في اختبار مسحة طبية مأخوذة من خلال مجهر ضوئي باستخدام تقنية التثبيت الرطب ، ووضع العينة على شريحة زجاجية وخلطها بمحلول ملحي

يستخدم الفحص المجهري البصري على نطاق واسع في الإلكترونيات الدقيقة والفيزياء النانوية والتكنولوجيا الحيوية والبحوث الصيدلانية وعلم المعادن وعلم الأحياء الدقيقة. ^[30]

يستخدم الفحص المجهري البصري للتشخيص الطبي ، حيث يطلق على المجال علم الأنسجة عند التعامل مع الأنسجة ، أو في اختبارات اللطاخة على الخلايا الحرة أو شظايا الأنسجة.

في الاستخدام الصناعي ، تعتبر المجاهر ثنائية العين شائعة. بصرف النظر عن التطبيقات التي تحتاج إلى إدراك حقيقي للعمق ، فإن استخدام العدسات المزدوجة يقلل من إجهاد العين المرتبط بأيام العمل الطويلة في محطة الفحص المجهري. في بعض التطبيقات ، تكون المجاهر التي تعمل لمسافات طويلة أو طويلة التركيز ^[31] مفيدة. قد يلزم فحص عنصر ما خلف نافذة ، أو قد تشكل الموضوعات الصناعية خطرًا على الهدف. تشبه هذه البصريات التلسكوبات بقدرات التركيز القريب. ^{[32] [33]}

تستخدم مجاهر القياس لقياس الدقة. هناك نوعان أساسيان. واحد لديه شبكاني متدرج للسماح بقياس المسافات في المستوى البؤري. ^{[34] النوع} الآخر (والأقدم) له شعيرات متصالبة بسيطة وآلية ميكرومتر لتحريك الموضوع بالنسبة إلى المجهر. ^[35]

وجدت المجاهر الصغيرة جدًا والمحمولة بعض الاستخدام في الأماكن التي يكون فيها المجهر المختبري عبئًا. ^[36]

حد الانعراج المحدد في الحجر على نصب تذكاري لإرنست آبي .

في حالات التكبير العالية جدًا مع الضوء المرسل ، يُنظر إلى الأجسام النقطية على أنها أقراص ضبابية محاطة بحلقات حيود . تسمى هذه الأقراص الهوائية . و حل السلطة يؤخذ المجهر والقدرة على التمييز بين قرصين المتقاربة إيري (أو، بعبارة أخرى قدرة المجهر للكشف عن التفاصيل الهيكلية المجاورة نحو مختلف ومنفصل). هذه التأثيرات للحيود هي التي تحد من القدرة على حل التفاصيل الدقيقة. مدى وحجم أنماط الحيود تتأثر كل من الطول الموجي لل ضوء (λ)، والمواد المستخدمة في صناعة الانكسار العدسة الشيئية و الفتحة العددية (NA) من عدسة الهدف. لذلك هناك حد محدود يستحيل بعده حل نقاط منفصلة في المجال الموضوعي ، يُعرف باسم حد الانعراج . بافتراض أن الانحرافات الضوئية في الإعداد البصري بالكامل لا تذكر ، يمكن تحديد الدقة d على النحو التالي:

${\ displaystyle d = {\ frac {\ lambda} {2NA}}}$

عادةً ما يُفترض أن الطول الموجي 550 نانومتر ، والذي يتوافق مع الضوء الأخضر . مع الهواء كوسيط خارجي ، فإن أعلى NA عملي هو 0.95 ، ومع الزيت ، يصل إلى 1.5. من الناحية العملية ، فإن أقل قيمة لـ d يمكن الحصول عليها باستخدام العدسات التقليدية هي حوالي 200 نانومتر. يسمح نوع جديد من العدسات باستخدام تشتت متعدد للضوء بتحسين الدقة إلى أقل من 100 نانومتر. ^[37]

تجاوز حد القرار

تتوفر تقنيات متعددة للوصول إلى درجات دقة أعلى من حد الضوء المرسل الموصوف أعلاه. تقنيات التصوير المجسم ، كما وصفها Courjon و Bulabois في عام 1979 ، قادرة أيضًا على كسر حد الدقة هذا ، على الرغم من أن الدقة كانت مقيدة في تحليلها التجريبي. ^[38]

استخدام عينات الفلورسنت المزيد من التقنيات المتاحة. ومن الأمثلة على ذلك Vertico SMI ، الفحص المجهري البصري القريب من المجال الذي يستخدم الموجات الزائلة ، وتحفيز استنفاد الانبعاث . في عام 2005 ، تم وصف مجهر قادر على اكتشاف جزيء واحد كأداة تعليمية. ^[39]

على الرغم من التقدم الكبير في العقد الماضي ، لا تزال تقنيات تجاوز حد الانعراج محدودة ومتخصصة.

بينما تركز معظم التقنيات على الزيادات في الدقة الجانبية ، هناك أيضًا بعض التقنيات التي تهدف إلى السماح بتحليل العينات الرفيعة للغاية. على سبيل المثال ، تضع طرق sarfus العينة الرقيقة على سطح معزز للتباين ، وبالتالي تسمح بتصور الأفلام بشكل مباشر برقعة 0.3 نانومتر.

في 8 تشرين الأول عام 2014، و جائزة نوبل في الكيمياء منحت ل إيريك بيتزيغ ، وليام مورنر و ستيفان هيل لتطوير-حل السوبر مضان المجهر . ^{[40] [41]}

الإضاءة الهيكلية SMI

SMI (الفحص المجهري للإضاءة المعدلة مكانيًا) هو عملية ضوئية ضوئية لما يسمى هندسة وظيفة انتشار النقطة (PSF). هذه هي العمليات التي تعدل PSF لمجهر بطريقة مناسبة إما لزيادة الدقة الضوئية ، لزيادة دقة قياسات المسافة لأجسام الفلورسنت الصغيرة بالنسبة لطول موجة الضوء المنير ، أو لاستخراج المعلمات الهيكلية الأخرى في نطاق النانومتر. ^{[42] [43]}

المجهري التعريب SPDMphymod

مجهر ثلاثي الأبعاد فائق الدقة مع Her2 و Her3 في خلايا الثدي ، الأصباغ القياسية: Alexa 488 ، Alexa 568 LIMON

SPDM (المجهر الطيفي الدقيق للمسافة) ، تقنية الفحص المجهري الأساسية للتوطين هي عملية بصرية ضوئية من الفحص المجهري الفلوري الذي يسمح بقياسات الموضع والمسافة والزاوية على جسيمات "معزولة بصريًا" (مثل الجزيئات) أقل بكثير من الحد النظري لدقة الفحص المجهري الضوئي. تعني عبارة "معزول بصريًا" أنه في نقطة زمنية معينة ، يتم تسجيل جسيم / جزيء واحد فقط داخل منطقة ذات حجم محدد بواسطة الاستبانة الضوئية التقليدية (عادة بقطر 200-250 نانومتر ). يكون هذا ممكنًا عندما تحمل جميع الجزيئات الموجودة في هذه المنطقة علامات طيفية مختلفة (على سبيل المثال ، ألوان مختلفة أو اختلافات أخرى قابلة للاستخدام في انبعاث الضوء من جسيمات مختلفة). ^{[44] [45] [46] [47]}

يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية القياسية مثل GFP ، وأصباغ Alexa ، وأصباغ Atto ، وجزيئات Cy2 / Cy3 و fluorescein في الفحص المجهري ، بشرط وجود بعض الظروف الفيزيائية للصور. باستخدام تقنية SPDMphymod (الفلورية القابلة للتعديل جسديًا) ، يكون الطول الموجي لليزر الفردي بكثافة مناسبة كافياً للتصوير النانوي. ^[48]

مجهر ثلاثي الأبعاد فائق الدقة

يمكن تحقيق مجهر ثلاثي الأبعاد فائق الدقة باستخدام الأصباغ الفلورية القياسية من خلال الجمع بين الفحص المجهري للتوطين للأصباغ الفلورية القياسية SPDMphymod والإضاءة المنظمة SMI. ^[49]

STED

صورة مجهرية لاستنفاد الانبعاث المستحث (STED) لخيوط الأكتين داخل الخلية.

استنفاد الانبعاث المحفز هو مثال بسيط على مدى إمكانية تجاوز الدقة الأعلى لحد الانعراج ، ولكن لها قيود كبيرة. STED هي تقنية مجهرية مضان تستخدم مزيجًا من نبضات الضوء للحث على التألق في مجموعة فرعية صغيرة من جزيئات الفلورسنت في العينة. ينتج كل جزيء بقعة ضوئية محدودة الانعراج في الصورة ، ويتوافق مركز كل من هذه البقع مع موقع الجزيء. نظرًا لأن عدد الجزيئات الفلورية منخفضة ، فمن غير المرجح أن تتداخل بقع الضوء وبالتالي يمكن وضعها بدقة. ثم يتم تكرار هذه العملية عدة مرات لإنشاء الصورة. حصل ستيفان هيل من معهد ماكس بلانك للكيمياء الفيزيائية الحيوية على جائزة المستقبل الألمانية العاشرة في عام 2006 وجائزة نوبل في الكيمياء في عام 2014 لتطويره مجهر STED والمنهجيات المرتبطة به. ^[50]

من أجل التغلب على القيود التي وضعها حد الانعراج للضوء المرئي ، تم تصميم مجاهر أخرى تستخدم موجات أخرى.

• مجهر القوة الذرية (AFM)
• مجهر المسح الإلكتروني (SEM)
• المسح المجهري للتوصيل الأيوني (SICM)
• مجهر المسح النفقي (STM)
• المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)
• مجهر الأشعة فوق البنفسجية
• مجهر الأشعة السينية

من المهم ملاحظة أن الموجات ذات التردد العالي لها تفاعل محدود مع المادة ، على سبيل المثال الأنسجة الرخوة شفافة نسبيًا للأشعة السينية مما ينتج عنه مصادر تباين مميزة وتطبيقات مستهدفة مختلفة.

يسمح استخدام الإلكترونات والأشعة السينية بدلاً من الضوء بدقة أعلى بكثير - يكون الطول الموجي للإشعاع أقصر وبالتالي يكون حد الانعراج أقل. لجعل المسبار ذو الطول الموجي القصير غير مدمر ، تم اقتراح نظام التصوير بالحزمة الذرية ( منظار النانو الذري ) ومناقشته على نطاق واسع في الأدبيات ، لكنه لم يتنافس بعد مع أنظمة التصوير التقليدية.

يقوم كل من STM و AFM بمسح تقنيات المسبار باستخدام مسبار صغير يتم مسحه ضوئيًا على سطح العينة. يقتصر الحل في هذه الحالات على حجم المسبار ؛ يمكن أن تنتج تقنيات micromachining مجسات ذات نصف قطر طرف من 5-10 نانومتر.

بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم طرق مثل الفحص المجهري للإلكترون أو الأشعة السينية الفراغ أو الفراغ الجزئي ، مما يحد من استخدامها للعينات الحية والبيولوجية (باستثناء المجهر الإلكتروني للمسح البيئي ). كما أن غرف العينات اللازمة لجميع هذه الأدوات تحد أيضًا من حجم العينة ، ويكون التلاعب بالعينة أكثر صعوبة. لا يمكن رؤية اللون في الصور التي تم إنشاؤها بهذه الطرق ، لذلك يتم فقد بعض المعلومات. ومع ذلك فهي، من الضروري عند التحقيق في الآثار الجزيئية أو الذرية، مثل تصلب السن في سبائك الألومنيوم ، أو المجهرية من البوليمرات .

• فان هيلدن ، ألبرت ؛ دوبري ، سفين ؛ فان جينت ، روب (2011). أصول التلسكوب . مطبعة جامعة أمستردام. رقم ISBN 978-9069846156.

• "تحضير العينات المعدنية والمادية ، الفحص المجهري الضوئي ، تحليل الصور واختبار الصلابة" ، Kay Geels بالتعاون مع Struers A / S ، ASTM International 2006.
• "الفحص المجهري الضوئي : ثورة معاصرة مستمرة" ، سيجفريد وايزنبرغر ووحيد ساندغدار ، arXiv: 1412.3255 2014.

• Antique Microscopes.com مجموعة من المجاهر المبكرة
• المجاهر التاريخية ، مجموعة مصورة تحتوي على أكثر من 3000 صورة مجاهر علمية من قبل صناع أوروبيين (بالألمانية)
• مجموعة Golub ، وهي مجموعة من مجاهر القرن السابع عشر حتى القرن التاسع عشر ، بما في ذلك أوصاف شاملة
• التعبيرات الجزيئية ، مفاهيم في المجهر الضوئي
• البرنامج التعليمي عبر الإنترنت للفحص المجهري البصري العملي
• OpenWetWare
• قاعدة بيانات مركزية الخلية